革蘭氏染色的詳細(xì)實驗步驟
革蘭氏染色的詳細(xì)實驗步驟:
1。 涂片：左手持菌液試管，右手持接種環(huán)，用接種環(huán)從試管培養(yǎng)液中取環(huán)菌，從酒精燈外焰穿過，于載玻片中央涂成薄層（事先在背面做好標(biāo)記圓圈）即可，或先滴小滴無菌水于載玻片中央，用接種環(huán)從斜面上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，涂成薄層。
拔或塞試管塞時，應(yīng)將試管口通過火焰略加燒灼，后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。
2。 干燥：涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。
3。 固定：常用高溫進(jìn)行固定。即手持載玻片端，標(biāo)本面朝上，在燈的火焰外側(cè)快速來回移動3~4次，共約3~4秒。要求玻片溫度不超過60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜，放置待冷后染色。
4. 染色：
（1）初染： 加草酸銨結(jié)晶紫滴，約分鐘，水洗。
（2）媒染： 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約分鐘，水洗。
（3）脫色： 將載玻片上的水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約20—30秒，立即用水沖凈酒精。
（4）復(fù)染： 用番紅液染1—2分鐘，水洗。
5. 鏡檢： 干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。
6. 同法在載玻片上以大腸桿菌與枯草芽孢桿菌混合制片，作革蘭氏染色對比。
革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)
