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革蘭氏染色劑不僅用來觀察細菌的形態，而且它還是細菌鑒定的重要方法，它可將全部細菌區分別革蘭氏陽性菌和陰性菌兩大類。革蘭氏染色法的步驟為：涂片→固定→結晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅復染→水洗→干燥→觀察。

涂片與單染色法相同。

固定與單染色法相同。

結晶紫染色染色1分鐘，然后水洗并用吸水紙吸干。

碘液媒染染色1分鐘，然后水洗并吸干。

酒精脫色用95%酒精脫色，直到酒精不出現紫色時即停止（大約半分鐘），然后立即水洗，并吸干。

番紅復染染色3分鐘左右，然后水洗并吸干。

鏡檢在顯微鏡油鏡頭下觀察，菌體顯藍紫色的為革蘭氏陽性菌；菌體顯紅色的為革蘭氏陰性菌。